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摘要：
線(xiàn)粒體和復雜的內膜系統是真核細胞的重要特征。到目前為止，對活細胞內的細胞器進(jìn)行操縱仍然十分困難。多功能單細胞顯微操作FluidFM技術(shù)能夠從活細胞中提取、注射細胞器，將定量的線(xiàn)粒體移植到細胞中，同時(shí)保持它們的活力。
近期，Julia A.Vorholt課題組使用多功能單細胞顯微操作FluidFM技術(shù)，將線(xiàn)粒體移植至培養的細胞中，并實(shí)時(shí)跟蹤線(xiàn)粒體注射后的情況，監測它們在新宿主細胞中的命運。通過(guò)跟蹤，作者發(fā)現與受體細胞線(xiàn)粒體網(wǎng)絡(luò )融合發(fā)生在移植后20分鐘，持續16小時(shí)以上?；罴毎g移植線(xiàn)粒體不僅為細胞器生理學(xué)的研究開(kāi)辟了新的前景，也為機械生物學(xué)、合成生物學(xué)和疾病治療開(kāi)辟了新的前景。該篇文章以”Mitochondria transplantation between living cells.”為題，發(fā)表在BioRxiv.上。
結果：
1.從活細胞中提取線(xiàn)粒體
為了檢測FluidFM探針對單細胞細胞器采樣的能力。作者使用了兩種探針，分別是錐型探針(A=1.2 um2)和圓柱型探針(A=1.6 um2)(圖1B)。實(shí)驗結果表明，使用這兩種探針都可以對線(xiàn)粒體及單個(gè)線(xiàn)粒體進(jìn)行提取或大量抽提。
作者對內質(zhì)網(wǎng)（ER）和線(xiàn)粒體提取后的細胞活力進(jìn)行了檢測，發(fā)現細胞仍保持較高的細胞活力(>95%)。為了進(jìn)一步確保FluidFM提取方案在探針插入時(shí)不會(huì )破壞細胞質(zhì)膜，作者使用熒光探針(mito-R-GECO1)監測細胞培養基中可能發(fā)生的Ca2+內流。實(shí)驗顯示，在操作過(guò)程中和操作后都沒(méi)有Ca2+流入，表明細胞器提取過(guò)程中細胞質(zhì)膜的完整性。
本研究還發(fā)現暴露在FluidFM負壓下的線(xiàn)粒體小體會(huì )經(jīng)歷形狀的轉變，類(lèi)似于“串上珍珠”的形態(tài)。其特征是離散的線(xiàn)粒體基質(zhì)球體狀，并且通過(guò)細長(cháng)的膜結構相互連接，在進(jìn)一步負壓拉力的作用下，這些球狀結構最終被拉斷，并在懸臂中呈現為球狀線(xiàn)粒體(圖2E)。進(jìn)一步探究顯示，施加FluidFM負壓后，力誘導的形狀轉變沿線(xiàn)粒體小管在毫秒到秒的范圍內傳播了數十微米。形狀轉變沿這一方向均勻傳播，而外層線(xiàn)粒體膜(OMM)保持了最初的完整性。當牽引力保持數秒后，OMM在先前形成的“珍珠”之間的一個(gè)或多個(gè)收縮點(diǎn)分離，從而產(chǎn)生獨立的球形線(xiàn)粒體，而管狀結構的其余部分放松并恢復。結合線(xiàn)粒體牽引實(shí)驗和線(xiàn)粒體定位的鈣流實(shí)驗，結果證明線(xiàn)粒體的串上珍珠表型的形狀轉變以及隨后細胞質(zhì)內的線(xiàn)粒體裂變是不依賴(lài)鈣的。
2.線(xiàn)粒體移植至新細胞
研究人員的下一個(gè)目標是將線(xiàn)粒體移植到新的宿主細胞中，并保持細胞活性。FluidFM技術(shù)為線(xiàn)粒體轉移提供了兩種可能性方案：方案一、用FluidFM技術(shù)直接提取線(xiàn)粒體而后注入到新的宿主細胞中；方案二、將從細胞中分離純化的線(xiàn)粒體回充入FluidFM探針，然后注射(圖3A-D)。作者比較了兩種方法，為了實(shí)現可視化的線(xiàn)粒體的轉移，作者在供體和受體細胞中分別對線(xiàn)粒體進(jìn)行了差異化標記(圖3E-F;供體細胞線(xiàn)粒體su9-mCherry和受體細胞線(xiàn)粒體su9-BFP)。當使用FluidFM直接將線(xiàn)粒體從一個(gè)細胞移植到另一個(gè)細胞時(shí)，成功率高達95%，而且保持了細胞活力(圖3G,41個(gè)移植細胞中有39個(gè))。在注射純化線(xiàn)粒體后，作者觀(guān)察到46%的樣本(19/41)發(fā)生了線(xiàn)粒體轉移且保持了細胞活力(圖3G)。移植的定量結果顯示，這些實(shí)驗中移植的線(xiàn)粒體數量從3到15個(gè)線(xiàn)粒體每個(gè)細胞不等(圖3H)。兩種替代方案的不同成功率可以由線(xiàn)粒體分離獲取的條件差異來(lái)解釋。在評估線(xiàn)粒體提取方案時(shí)，作者觀(guān)察到部分提取的線(xiàn)粒體外膜發(fā)生破裂。線(xiàn)粒體的不可逆損傷導致細胞內降解，細胞色素C釋放可能導致細胞凋亡。
雖然線(xiàn)粒體的細胞間移植降低了通量，但它的優(yōu)點(diǎn)是細胞外時(shí)間短(<1分鐘)，并且通過(guò)FluidFM采樣的線(xiàn)粒體大限度地集中在原生細胞質(zhì)液中，完全避免了人工緩沖液的使用。在提取和移植之前，作者通過(guò)在探針中填充不混溶的C8F18來(lái)確保提取液在提取過(guò)程中保持在孔徑附近。因此，只有很小的體積(0.5-2pL)被注入到宿主細胞中(圖3B)。
除了標記供體細胞的線(xiàn)粒體(su9-mCherry)外，還標記了受體細胞的線(xiàn)粒體(su9-BFP)，這樣就能夠觀(guān)察移植細胞線(xiàn)粒體網(wǎng)絡(luò )的實(shí)時(shí)狀態(tài)。在上述兩種移植方案(移植和純化后注射)中，宿主-線(xiàn)粒體網(wǎng)絡(luò )的管狀狀態(tài)不會(huì )因注射過(guò)程而產(chǎn)生影響。此外，標記可以讓作者可視化地監測線(xiàn)粒體地移植，觀(guān)察線(xiàn)粒體地融合。無(wú)論移植方法是細胞到細胞(圖3I)，還是注射純化線(xiàn)粒體(圖3J)，都可以觀(guān)察到這些過(guò)程。實(shí)驗跟蹤了22個(gè)細胞的移植命運：18個(gè)細胞顯示移植的線(xiàn)粒體完全融合，4個(gè)細胞的線(xiàn)粒體發(fā)生降解。多數細胞樣本(18個(gè)細胞中的14個(gè))在移植后30分鐘內初次觀(guān)察到融合事件。
如上所述，細胞間移植即方案一的效率高，并可以直接觀(guān)察單個(gè)移植線(xiàn)粒體的命運。為了展示這一點(diǎn)，作者將標記好的線(xiàn)粒體(su9-mCherry)從HeLa細胞移植到差異標記的U2OS細胞(su9-BFP)中，這種細胞通常用于研究動(dòng)態(tài)線(xiàn)粒體行為。高靈敏度相機可以用于追蹤受體細胞內的單個(gè)線(xiàn)粒體(圖3L)。作者觀(guān)察到熒光線(xiàn)粒體基質(zhì)標簽在移植后23分鐘的發(fā)生初始融合而后擴展到線(xiàn)粒體網(wǎng)絡(luò )。
綜上所述，作者建立了兩種將線(xiàn)粒體轉移到單個(gè)培養細胞的方法。一種方法是活細胞間移植。該方案顯示移植后細胞活力高，允許觀(guān)察移植后線(xiàn)粒體的動(dòng)態(tài)行為，是一種高效方案。第二種方法是大量純化線(xiàn)粒體并將其注射到受體細胞中。注射速度相當快，但不可避免地損害線(xiàn)粒體和細胞功能。
(F)通過(guò)方案二（純化線(xiàn)粒體注入細胞）進(jìn)行線(xiàn)粒體移植后的受體細胞圖像。宿主細胞的線(xiàn)粒體通過(guò)su9-BFP標記，移植細胞線(xiàn)粒體通過(guò)su9-mCherry標記。Scale bar=10μm。(G)通過(guò)光學(xué)成像對兩種方案注射的細胞進(jìn)行評估。每種方法評估了40個(gè)細胞。(H)兩種方案的線(xiàn)粒體的絕對計數評估。每種方法評估了22個(gè)細胞。(I)方案一移植線(xiàn)粒體后，對移植線(xiàn)粒體(su9-mCherry)和宿主線(xiàn)粒體網(wǎng)絡(luò )(su9-BFP)使用不同的熒光標記進(jìn)行成像，融合。Scale bar=5μm。(J)方案二注入純化線(xiàn)粒體后移的融合狀態(tài)，標記方案同(I)。Scale bar=5μm。(K)移植線(xiàn)粒體發(fā)生降解，分裂成多個(gè)更小的熒光囊泡(su9-mCherry)，熒光與標記的宿主細胞線(xiàn)粒體網(wǎng)絡(luò )(su9-BFP)沒(méi)有重疊。Scale bar=5μm。(L)單個(gè)移植線(xiàn)粒體的延時(shí)圖像序列(su9-mCherry)。細胞器供體為HeLa細胞，受體細胞為U2OS細胞，帶有熒光標記線(xiàn)粒體網(wǎng)絡(luò )(su9-BFP)。Scale bar=10μm。
討論
單細胞的操縱一直是細胞生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，尤其是在不損害細胞活力的情況下從細胞中提取細胞器或將外源物質(zhì)直接導入到細胞中。截止到目前，盡管單細胞技術(shù)有了較大的發(fā)展，但要實(shí)現將細胞器從一個(gè)細胞移植到另一個(gè)細胞，除了更大的卵母細胞外，幾乎是不可能實(shí)現的。
線(xiàn)粒體是細胞中的能量轉換的核心，與細胞代謝和信號通路以及細胞命運緊密聯(lián)系在一起。線(xiàn)粒體含有自身的遺傳成分(mtDNA)，通常是嚴格垂直遺傳給子細胞的。目前將線(xiàn)粒體準確地轉移到細胞的手段有限，對于線(xiàn)粒體移植后的劑量-反應關(guān)系分析更是十分困難，這樣我們就很難從機制上了解健康或疾病細胞的線(xiàn)粒體移植后的生物學(xué)效應。
本文使用的FluidFM技術(shù)采用微型探針，可以在微環(huán)境中以高時(shí)空分辨率操縱單細胞或者對單個(gè)細胞進(jìn)行采樣，并與組學(xué)方法相結合，使細胞器的研究成為可能。FluidFM技術(shù)將原子力顯微鏡的高精度力學(xué)調節手段與光學(xué)檢測下的納米尺度微流控系統相結合，提供與單細胞操作相關(guān)的力學(xué)和定量的體積控制。這些特性在現有微型探針中是的，在本研究中，作者將FluidFM單細胞技術(shù)用于活細胞真核內和細胞間的細胞器微操作。成功實(shí)現了活細胞之間的線(xiàn)粒體移植。
該研究將啟發(fā)人們將FluidFM技術(shù)應用于更多領(lǐng)域，例如，干細胞治療中低代謝活性細胞的再生，作為線(xiàn)粒體替代治療方法的一種備選方案等。此外，FluidFM技術(shù)為解決細胞生物學(xué)、生物力學(xué)和細胞工程等問(wèn)題提供了新的視角。
多功能單細胞顯微操作系統-FluidFM OMNIUM
[1].C.G?belein,Q.Feng,E.Sarajlic,T.Zambelli,O.Guillaume-Gentil,B.Kornmann&J.Vorholt.Mitochondria transplantation between living cells.(2021).BioRxiv.
線(xiàn)粒體和復雜的內膜系統是真核細胞的重要特征。到目前為止，對活細胞內的細胞器進(jìn)行操縱仍然十分困難。多功能單細胞顯微操作FluidFM技術(shù)能夠從活細胞中提取、注射細胞器，將定量的線(xiàn)粒體移植到細胞中，同時(shí)保持它們的活力。
近期，Julia A.Vorholt課題組使用多功能單細胞顯微操作FluidFM技術(shù)，將線(xiàn)粒體移植至培養的細胞中，并實(shí)時(shí)跟蹤線(xiàn)粒體注射后的情況，監測它們在新宿主細胞中的命運。通過(guò)跟蹤，作者發(fā)現與受體細胞線(xiàn)粒體網(wǎng)絡(luò )融合發(fā)生在移植后20分鐘，持續16小時(shí)以上?；罴毎g移植線(xiàn)粒體不僅為細胞器生理學(xué)的研究開(kāi)辟了新的前景，也為機械生物學(xué)、合成生物學(xué)和疾病治療開(kāi)辟了新的前景。該篇文章以”Mitochondria transplantation between living cells.”為題，發(fā)表在BioRxiv.上。
結果：
1.從活細胞中提取線(xiàn)粒體
為了檢測FluidFM探針對單細胞細胞器采樣的能力。作者使用了兩種探針，分別是錐型探針(A=1.2 um2)和圓柱型探針(A=1.6 um2)(圖1B)。實(shí)驗結果表明，使用這兩種探針都可以對線(xiàn)粒體及單個(gè)線(xiàn)粒體進(jìn)行提取或大量抽提。
作者對內質(zhì)網(wǎng)（ER）和線(xiàn)粒體提取后的細胞活力進(jìn)行了檢測，發(fā)現細胞仍保持較高的細胞活力(>95%)。為了進(jìn)一步確保FluidFM提取方案在探針插入時(shí)不會(huì )破壞細胞質(zhì)膜，作者使用熒光探針(mito-R-GECO1)監測細胞培養基中可能發(fā)生的Ca2+內流。實(shí)驗顯示，在操作過(guò)程中和操作后都沒(méi)有Ca2+流入，表明細胞器提取過(guò)程中細胞質(zhì)膜的完整性。
本研究還發(fā)現暴露在FluidFM負壓下的線(xiàn)粒體小體會(huì )經(jīng)歷形狀的轉變，類(lèi)似于“串上珍珠”的形態(tài)。其特征是離散的線(xiàn)粒體基質(zhì)球體狀，并且通過(guò)細長(cháng)的膜結構相互連接，在進(jìn)一步負壓拉力的作用下，這些球狀結構最終被拉斷，并在懸臂中呈現為球狀線(xiàn)粒體(圖2E)。進(jìn)一步探究顯示，施加FluidFM負壓后，力誘導的形狀轉變沿線(xiàn)粒體小管在毫秒到秒的范圍內傳播了數十微米。形狀轉變沿這一方向均勻傳播，而外層線(xiàn)粒體膜(OMM)保持了最初的完整性。當牽引力保持數秒后，OMM在先前形成的“珍珠”之間的一個(gè)或多個(gè)收縮點(diǎn)分離，從而產(chǎn)生獨立的球形線(xiàn)粒體，而管狀結構的其余部分放松并恢復。結合線(xiàn)粒體牽引實(shí)驗和線(xiàn)粒體定位的鈣流實(shí)驗，結果證明線(xiàn)粒體的串上珍珠表型的形狀轉變以及隨后細胞質(zhì)內的線(xiàn)粒體裂變是不依賴(lài)鈣的。
2.線(xiàn)粒體移植至新細胞
研究人員的下一個(gè)目標是將線(xiàn)粒體移植到新的宿主細胞中，并保持細胞活性。FluidFM技術(shù)為線(xiàn)粒體轉移提供了兩種可能性方案：方案一、用FluidFM技術(shù)直接提取線(xiàn)粒體而后注入到新的宿主細胞中；方案二、將從細胞中分離純化的線(xiàn)粒體回充入FluidFM探針，然后注射(圖3A-D)。作者比較了兩種方法，為了實(shí)現可視化的線(xiàn)粒體的轉移，作者在供體和受體細胞中分別對線(xiàn)粒體進(jìn)行了差異化標記(圖3E-F;供體細胞線(xiàn)粒體su9-mCherry和受體細胞線(xiàn)粒體su9-BFP)。當使用FluidFM直接將線(xiàn)粒體從一個(gè)細胞移植到另一個(gè)細胞時(shí)，成功率高達95%，而且保持了細胞活力(圖3G,41個(gè)移植細胞中有39個(gè))。在注射純化線(xiàn)粒體后，作者觀(guān)察到46%的樣本(19/41)發(fā)生了線(xiàn)粒體轉移且保持了細胞活力(圖3G)。移植的定量結果顯示，這些實(shí)驗中移植的線(xiàn)粒體數量從3到15個(gè)線(xiàn)粒體每個(gè)細胞不等(圖3H)。兩種替代方案的不同成功率可以由線(xiàn)粒體分離獲取的條件差異來(lái)解釋。在評估線(xiàn)粒體提取方案時(shí)，作者觀(guān)察到部分提取的線(xiàn)粒體外膜發(fā)生破裂。線(xiàn)粒體的不可逆損傷導致細胞內降解，細胞色素C釋放可能導致細胞凋亡。
雖然線(xiàn)粒體的細胞間移植降低了通量，但它的優(yōu)點(diǎn)是細胞外時(shí)間短(<1分鐘)，并且通過(guò)FluidFM采樣的線(xiàn)粒體大限度地集中在原生細胞質(zhì)液中，完全避免了人工緩沖液的使用。在提取和移植之前，作者通過(guò)在探針中填充不混溶的C8F18來(lái)確保提取液在提取過(guò)程中保持在孔徑附近。因此，只有很小的體積(0.5-2pL)被注入到宿主細胞中(圖3B)。
除了標記供體細胞的線(xiàn)粒體(su9-mCherry)外，還標記了受體細胞的線(xiàn)粒體(su9-BFP)，這樣就能夠觀(guān)察移植細胞線(xiàn)粒體網(wǎng)絡(luò )的實(shí)時(shí)狀態(tài)。在上述兩種移植方案(移植和純化后注射)中，宿主-線(xiàn)粒體網(wǎng)絡(luò )的管狀狀態(tài)不會(huì )因注射過(guò)程而產(chǎn)生影響。此外，標記可以讓作者可視化地監測線(xiàn)粒體地移植，觀(guān)察線(xiàn)粒體地融合。無(wú)論移植方法是細胞到細胞(圖3I)，還是注射純化線(xiàn)粒體(圖3J)，都可以觀(guān)察到這些過(guò)程。實(shí)驗跟蹤了22個(gè)細胞的移植命運：18個(gè)細胞顯示移植的線(xiàn)粒體完全融合，4個(gè)細胞的線(xiàn)粒體發(fā)生降解。多數細胞樣本(18個(gè)細胞中的14個(gè))在移植后30分鐘內初次觀(guān)察到融合事件。
如上所述，細胞間移植即方案一的效率高，并可以直接觀(guān)察單個(gè)移植線(xiàn)粒體的命運。為了展示這一點(diǎn)，作者將標記好的線(xiàn)粒體(su9-mCherry)從HeLa細胞移植到差異標記的U2OS細胞(su9-BFP)中，這種細胞通常用于研究動(dòng)態(tài)線(xiàn)粒體行為。高靈敏度相機可以用于追蹤受體細胞內的單個(gè)線(xiàn)粒體(圖3L)。作者觀(guān)察到熒光線(xiàn)粒體基質(zhì)標簽在移植后23分鐘的發(fā)生初始融合而后擴展到線(xiàn)粒體網(wǎng)絡(luò )。
綜上所述，作者建立了兩種將線(xiàn)粒體轉移到單個(gè)培養細胞的方法。一種方法是活細胞間移植。該方案顯示移植后細胞活力高，允許觀(guān)察移植后線(xiàn)粒體的動(dòng)態(tài)行為，是一種高效方案。第二種方法是大量純化線(xiàn)粒體并將其注射到受體細胞中。注射速度相當快，但不可避免地損害線(xiàn)粒體和細胞功能。
(F)通過(guò)方案二（純化線(xiàn)粒體注入細胞）進(jìn)行線(xiàn)粒體移植后的受體細胞圖像。宿主細胞的線(xiàn)粒體通過(guò)su9-BFP標記，移植細胞線(xiàn)粒體通過(guò)su9-mCherry標記。Scale bar=10μm。(G)通過(guò)光學(xué)成像對兩種方案注射的細胞進(jìn)行評估。每種方法評估了40個(gè)細胞。(H)兩種方案的線(xiàn)粒體的絕對計數評估。每種方法評估了22個(gè)細胞。(I)方案一移植線(xiàn)粒體后，對移植線(xiàn)粒體(su9-mCherry)和宿主線(xiàn)粒體網(wǎng)絡(luò )(su9-BFP)使用不同的熒光標記進(jìn)行成像，融合。Scale bar=5μm。(J)方案二注入純化線(xiàn)粒體后移的融合狀態(tài)，標記方案同(I)。Scale bar=5μm。(K)移植線(xiàn)粒體發(fā)生降解，分裂成多個(gè)更小的熒光囊泡(su9-mCherry)，熒光與標記的宿主細胞線(xiàn)粒體網(wǎng)絡(luò )(su9-BFP)沒(méi)有重疊。Scale bar=5μm。(L)單個(gè)移植線(xiàn)粒體的延時(shí)圖像序列(su9-mCherry)。細胞器供體為HeLa細胞，受體細胞為U2OS細胞，帶有熒光標記線(xiàn)粒體網(wǎng)絡(luò )(su9-BFP)。Scale bar=10μm。
討論
單細胞的操縱一直是細胞生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，尤其是在不損害細胞活力的情況下從細胞中提取細胞器或將外源物質(zhì)直接導入到細胞中。截止到目前，盡管單細胞技術(shù)有了較大的發(fā)展，但要實(shí)現將細胞器從一個(gè)細胞移植到另一個(gè)細胞，除了更大的卵母細胞外，幾乎是不可能實(shí)現的。
線(xiàn)粒體是細胞中的能量轉換的核心，與細胞代謝和信號通路以及細胞命運緊密聯(lián)系在一起。線(xiàn)粒體含有自身的遺傳成分(mtDNA)，通常是嚴格垂直遺傳給子細胞的。目前將線(xiàn)粒體準確地轉移到細胞的手段有限，對于線(xiàn)粒體移植后的劑量-反應關(guān)系分析更是十分困難，這樣我們就很難從機制上了解健康或疾病細胞的線(xiàn)粒體移植后的生物學(xué)效應。
本文使用的FluidFM技術(shù)采用微型探針，可以在微環(huán)境中以高時(shí)空分辨率操縱單細胞或者對單個(gè)細胞進(jìn)行采樣，并與組學(xué)方法相結合，使細胞器的研究成為可能。FluidFM技術(shù)將原子力顯微鏡的高精度力學(xué)調節手段與光學(xué)檢測下的納米尺度微流控系統相結合，提供與單細胞操作相關(guān)的力學(xué)和定量的體積控制。這些特性在現有微型探針中是的，在本研究中，作者將FluidFM單細胞技術(shù)用于活細胞真核內和細胞間的細胞器微操作。成功實(shí)現了活細胞之間的線(xiàn)粒體移植。
該研究將啟發(fā)人們將FluidFM技術(shù)應用于更多領(lǐng)域，例如，干細胞治療中低代謝活性細胞的再生，作為線(xiàn)粒體替代治療方法的一種備選方案等。此外，FluidFM技術(shù)為解決細胞生物學(xué)、生物力學(xué)和細胞工程等問(wèn)題提供了新的視角。
多功能單細胞顯微操作系統-FluidFM OMNIUM
[1].C.G?belein,Q.Feng,E.Sarajlic,T.Zambelli,O.Guillaume-Gentil,B.Kornmann&J.Vorholt.Mitochondria transplantation between living cells.(2021).BioRxiv.
